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基本信息

品系名稱：B6-Akt1^tm1小鼠

英文名稱：B6-Akt1^tm1 mice

疾病名稱：糖尿病、癌癥等

相關基因：NA

背景品系：C57BL/6J

遺傳類型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代數：NA

研究用途：糖尿病、癌癥等、細胞生物學過程及信號轉導方面的研究。

飼養環境：屏障或隔離環境

培育單位：北京華阜康生物科技股份有限公司、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

保種單位：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

資源鑒定：否

鑒定日期：暫無介紹

特征描述

 

 

蛋白激酶B又名Akt，分子量為56道爾頓，因其具有與蛋白激酶A與C的高度同源性而被命名為蛋白激酶B。隨著小鼠胸腺瘤中的反轉錄病毒v—Akt的提純，同源基因c—Akt也被發現，其編碼的蛋白產物能使絲氨酸／蘇氨酸磷酸化，稱之為絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶Akt。研究發現，人類至少存在3種Akt家族成員：Aktl／PKBa、Akt2／PKBβ和Akt3／PKBγ．Aktl／2／3分別位于14號染色體短臂3區2帶，19號染色體短臂l區3帶和1號染色體短臂4區4帶。Aktl和Akt2在人體的大腦、胸腺與心肺中廣泛分布，水平較高，而Akt3則主要在人體的大腦和睪丸中表達，在心肺、脾和骨骼肌中水平較低，該3種異構體均有相似的催化功能域，可被第二信使調節，是細胞生長信號通路中的傳感器，在生長因子或胰島素介導的信號轉導中扮演重要角色，在營養代謝、細胞生長、轉錄調控和細胞存活中也具有重要作用。

 

PKB結構

3種Akt的異構體都包含相同的保守功能域結構：N端的PH功能域，中間的激酶催化功能域和C端含疏水基序的調節功能域．PH功能域包括大約100個氨基酸，可與細胞膜上由P13K產生的PIP3的頭基結合，并存在PDKl的結合位點，阻斷這種結合會加重AGC激酶活化環的磷酸化。PKB的催化功能域在分子的中間區域，與PKC、P70S6K等AGC激酶高度相似，該功能域的氨基小葉中存在一個活化環，在活化環中的DFG和APE基序間有一個保守的蘇氨酸殘基308，該殘基的磷酸化可部分激活PKB。所有PKB異構體C端均有一個約40個氨基酸的延伸片段，該區域含有疏水基序(hydrophobicmotif，HM)，人體PKB的HM序列為：苯丙氨酸／脯氨酸／谷氨酰胺／苯丙氨酸／絲氨酸／酪氨酸。當PKB的HM發生缺失突變時，Akt的酶活性會完全喪失，最新的研究表明，HM對于PKB的激酶催化活性具有變構調節作用，催化功能域的氨基小葉和αB螺旋、αC螺旋以及β—5片狀結構形成一個疏水性的磷酸化袋狀結構，HM通過與該結構的結合，增強催化功能域的穩定性，提高磷酸基團的轉移率。

PKB的磷酸化調節

PKB含有2個特殊的磷酸化位點，Aktl的蘇氨酸殘基308位于激酶催化功能域的活化環上，而絲氨酸殘基473則位于C端調節域中，Akt2的相應殘基為蘇氨酸309和絲氨酸474，而Akt3由于只有454個殘基，其相應的殘基位為蘇氨酸305，PKB被IGF-1信號通路激活時，伴隨著蘇氨酸殘基308和絲氨酸殘基473的磷酸化，當使用P13K抑制劑時，殘基的磷酸化和PKB的激活同時消失，當蘇氨酸殘基308和絲氨酸殘基473發生丙氨酸突變時，PKB的活性下降85％一95％．而當蘇氨酸殘基308或絲氨酸殘基473發生天冬氨酸突變時，PKB的活性可增大5倍．兩者同時發生天冬氨酸突變時，PKB的活性可增大20倍，蘇氨酸殘基308發生單磷酸化時，若絲氨酸殘基473未被磷酸化，C端小葉上的aB和C螺旋以及活化環會發生紊亂；若絲氨酸殘基473發生天冬氨酸突變時，激酶催化功能域會從無序轉化為有序，導致激酶催化功能域穩定在激活狀態。蘇氨酸殘基308的磷酸化可部分活化PKB，絲氨酸殘基473的單獨磷酸化則對PKB的活性基本無效，但PKB的完全激活則需要絲氨酸殘基473的磷酸化。蘇氨酸殘基308是被PDKl磷酸化的，但絲氨酸殘基473的磷酸化則充滿爭議．理論上，絲氨酸殘基473的磷酸化和蘇氨酸殘基308一樣依賴于P13K，PDKl應成為絲氨酸殘基473的磷酸化激酶，但敲除PDKl的ES細胞中絲氨酸殘基473呈現出與野生型細胞相似的磷酸化，而蘇氨酸殘基308的磷酸化則完全消除．但過表達的PDKl可以增加絲氨酸殘基473的磷酸化，表明PDKl可以間接增加絲氨酸殘基473的磷酸化。有報道認為，在某種情況下PKB可以發生自磷酸化以及絲氨酸殘基473被PDK2磷酸化，此外，ILK也與絲氨酸殘基473的磷酸化相關，它可以磷酸化絲氨酸殘基473，其抑制劑可以阻斷PKB絲氨酸殘基473的磷酸化，這些研究表明，ILK在絲氨酸殘基473的激活過程中發揮作用，但能否直接磷酸化PKB則還充滿爭議，研究表明，酪氨酸磷酸化在PKB調節中發揮作用。PKB催化區域中的酪氨酸殘基315和326可通過PKB C端的脯氨酸／X／X／脯氨酸模序(X為任意氨基酸)與Src分子C端的SH3功能域結合，導致磷酸化，在胰島素和過釩酸鈉作用下，酪氨酸殘基474會被磷酸化，該殘基突變為苯丙氨酸時，會減少蘇氨酸殘基308的磷酸化程度，使PKB活性下降55％。PKB的晶體結構顯示，酪氨酸殘基474參與HM與疏水袋結合的過程，酪氨酸殘基474的芳香環與亮氨酸殘基214相互作用，羥基與精氨酸殘基207形成氫鍵結合。因此，當474突變后，HM與疏水袋親和力下降，造成PKB的活性降低．而這也會降低PKDl與PKB的作用能力．絲氨酸殘基473與酪氨酸殘基474的磷酸化是互斥的，對磷酰氨基酸和胰蛋白多肽的分析顯示，兩者從不同時磷酸化，這提示磷酸化的絲氨酸殘基474具有阻斷殘基473的作用，表明474殘基的磷酸化可以抑制PKB的活性．由于這些酪氨酸在AGC激酶中普遍存在，這也可能是AGC蛋白家族的普遍調節機制。

PKB的上游物質

通常，PKB在沒有受到外界刺激時一般以非活化形式在細胞質中表達，當存在IGF-1等刺激時，細胞膜上的受體酪氨酸激酶磷酸化，P13K信號通路激活，P13K是產生第二信使3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇的關鍵酶，3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇可與PKB的PH結構域結合，使PKB從細胞質異位至細胞膜，并發生構象改變，當存在P13K抑制劑或PH功能域缺失時，該異位被阻斷。當PKB異位至細胞膜并發生構象改變后，PIP3可激活PDKl的活性，導致PDKl和PDK2磷酸化激酶催化功能域活化環上蘇氨酸殘基308和調節功能域絲氨酸殘基473磷酸化以及余下的激活過程可被P13K的抑制劑渥曼青霉素和LY294002阻斷。絲氨酸殘基473的磷酸化是PKB激活的關鍵步驟，可穩定其活化狀態，當絲氨酸殘基473被磷酸化后，PKB從細胞膜進人細胞質或細胞核．此外，cAMP-PKA途徑、鈣調蛋白激酶和熱休克蛋白27等可以獨立激活PKB。

PKB的生理作用

PKB可以促進細胞增殖

p21及其相關家族成員p27可以通過可逆抑制一些周期素依賴激酶來阻斷細胞周期，而PKB通過磷酸化p2l可以抑制細胞周期阻滯，表皮生長因子受體-2在乳腺癌和卵巢癌中過表達能激活PKB，PKB磷酸化p21的蘇氨酸145殘基．該過程本身不影響p21的抑制作用，但可以阻止p21進入細胞核，而p21必須在細胞核中才能發揮其抑制細胞增殖的作用。PKB還可以調節周期素依賴激酶抑制子p27的轉錄，激活的PKB或過表達的PKB可以降低p27在細胞中的水平，促進細胞增殖．此外，細胞周期進程的關鍵調節者還包括細胞周期蛋白(D1／D2／D3)，它可以刺激G1期，其需要細胞周期蛋白激酶4和細胞周期蛋白激酶6的活性．細胞周期蛋白受轉錄水平、翻譯和蛋白穩定性控制，許多生長因子促進細胞周期蛋白的轉錄，P13K信號通路在此過程中扮演重要角色．過表達的P13K和PKB可以刺激細胞周期蛋白的翻譯率。細胞周期蛋白水平受其從細胞核異位至細胞膜的影響，在細胞膜細胞周期蛋白1可被蛋白體的泛素化降解，其關鍵的步驟是由GS3磷酸化細胞周期蛋白l的蘇氨酸殘基286，這可以促進細胞周期蛋白1與核輸出蛋白染色體區域維持蛋白1的結合，激活的PKB可以導致GS3的失活，降低GSK3對細胞周期蛋白1的磷酸化，保持細胞核中細胞周期蛋白l的較高水平。E2F是一種通用轉錄因子，控制多種DNA合成及細胞周期調節蛋白基因的轉錄，在細胞進入細胞周期前，E2F與袋狀分子結合而處于無活性狀態．當這些袋狀蛋白在細胞周期蛋白和(或)細胞周期依賴性蛋白激酶磷酸化時，E2F被釋放而得以發揮轉錄調節活性．PKB通過降低p27的表達，使袋狀分子高度磷酸化，促進E2F的轉錄活性，使細胞從G1期進入s期。

PKB可以抑制細胞凋亡

血清和某些生長因子能抑制細胞的凋亡，但它們傳遞抗凋亡信號的機制尚不清楚。Kennedy等研究了5種生長因子的下游底物，Ras、Raf、Src、P13K和PKB的抑制凋亡能力發現，Ras、Raf和Src都不能傳遞存活信號，而P13K的抑制能促進凋亡，PKB的活化則能抑制凋亡。PKB可以通過抑制調節凋亡的蛋白來促進細胞生存，PKB的底物BAD可以通過與Bcl—x。的結合來促進凋亡，PKB磷酸化BAD可以使BAD與14—3—3蛋白結合，阻止其與Bcl-XL結合來抑制凋亡．叉頭蛋白家族成員都含有Akt磷酸化的序列，可被Akt磷酸化．而磷酸化修飾可使叉頭蛋白改變其細胞定位，在未被Akt磷酸化修飾時它們大部分定位于細胞核，促進凋亡相關基因Fas—L和Bim的轉錄，促進細胞凋亡．被Akt磷酸化活化后，它們從細胞核異位至細胞質與14-3-3蛋白結合，抑制細胞凋亡。此外，PKB還可以直接磷酸化并抑制caspase蛋白酶．大多數easpase具有PKB磷酸化位點，調節凋亡的關鍵酶caspase-9的磷酸化位點為絲氨酸196。PKB可以磷酸化caspase-9從而阻斷內源性蛋白酶活性，在凋亡控制過程中發揮重要功能，過表達的活性PKB還可磷酸化凋亡信號調節激酶I的絲氨酸殘基83，抑制其活性，并降低具有促凋亡作用的JNK活性。

PKB促進胰島素信號應答

PKB是P13K的關鍵下游效應子，PKBβ在脂肪組織等胰島素應答組織中高表達，是保證糖原正常合成的關鍵基因。PKBβ缺乏的小鼠表現出典型的Ⅱ型糖尿病特征，以及肝臟和肌肉出現胰島素抵抗。隨著胰島素水平增高，胰島的體積和數量發生顯著增加。糖原合成酶激酶3在胰島素刺激時可以磷酸化滅活糖原合成酶，該激酶是PKB的底物，GSK3a和β的磷酸化位點絲氨酸21和絲氨酸9均可被PKB磷酸化而失活，PKB的P13K依賴形式介導該過程，構成了胰島素調節糖原合成信號通路中的重要旁路。研究表明，PKB磷酸化滅活GSK3后，可以導致肝臟和脂肪組織葡萄糖和氨基酸轉化為糖原和蛋白質。PKB可以磷酸化激活脂肪組織中的cAMP-磷酸二酯酶3B絲氨酸殘基273，導致磷酸二酯酶3B的激活，降低cAMP的活性以及PKA的活性，并調節細胞內環核苷酸的水平．心臟6-磷酸果糖激酶-2可被PKB磷酸化絲氨酸殘基466，導致酶活性增高，促進糖酵解。葡萄糖運輸蛋白4是胰島素敏感的葡萄糖轉運分子之一．在胰島素的作用下，GluT4從胞漿向質膜移位。Akt可以促進葡萄搪的轉運和葡萄糖運輸蛋白4向質膜的移位，增加葡萄糖的運輸，并可促進脂肪細胞的分化，其可能機制為當存在胰島素等刺激因子時，PKB在細胞膜上被PDKl和PDK2完全活化，進入特定的葡萄糖運輸蛋白4小泡中，促使其異位至細胞膜上，其他PKB的底物包括胰島素受體底物1，它的磷酸化可以抑制P13K募集到細胞膜上，在胰島素長期刺激時，在切斷P13K活性的負反饋通路中具有重要作用。PKB的過表達在幾個胰島素反應細胞株中可以刺激營養的攝取如葡萄糖和氨基酸，并誘導其基因表達通常介導的胰島素【1】。

PKB與腫瘤血管及侵襲性的關系

PKB與腫瘤血管生成的關系

PKB 可直接磷酸化和活化內皮型一氧化氮合酶( Endothelialnitric oxide synthase，e NOS)，活化的PKB 可以和 eNOS 共定位于細胞膜，促進新生血管的形成和 VEGF 導致的細胞遷移。eNOS 是心血管穩態的重要調節因子，它可以被 PKB 磷酸化絲氨酸-1177 位點而活化，誘導血管內皮細胞產生一氧化氮( NO)。PI3K- PKB- eNOS 信號轉導通路被激活可產生大量 NO，NO 在調節血管張力、血管重塑、內皮生長和血管生成中起著至關重要的作用，PKB位于此通路的中心環節。Angiopoietin1( ANG1) 是一種促進血管內皮細胞的分化和血管新生的重要的血管生成因子，ANG1 可以通過激活 PI3K/PKB 的途徑防止內皮細胞凋亡，還可以激活 eNOS。血管內皮生長因子可以誘發內皮細胞釋放一氧化氮( NO)，釋放的 NO 可上調某些細胞血管內皮生長因子 mRNA的表達，增強血管內皮生長因子的合成。內源性NO和VEGF 之間的良性互動，共同促進血管的生成。血管生成與腫瘤的發生、生長、轉移、分期密切相關，參與腫瘤血管生成的因子中VEGF作用最強。eNOS、HIF 等對 VEGF 起調節作用的眾多因子均與 PKB 活化密切相關，PKB 可能是調控 VEGF 表達通路中的關鍵蛋白，打斷和抑制 PKB 通路，有可能抑制腫瘤血管的生成。有研究顯示，PKB 在 VEGF 誘導的促血管生成作用中起著重要的調節作用，周曉東等研究表明，pAkt 蛋白可能促進胃癌的血管新生。

PKB與腫瘤細胞侵襲轉移的關系

腫瘤的侵襲和轉移是腫瘤細胞的惡性生物學行為，是一個多環節、多因素、多基因參與的復雜過程，也是臨床絕大多數腫瘤患者致死的原因，因此研究腫瘤細胞侵襲及轉移具有十分重要的臨床意義。近年來研究表明 PI3K/AKT 信號通路在生長性的細胞遷移和癌細胞遷移中均發揮著重要作用，可促進腫瘤轉移與侵襲。在哺乳類細胞中，PI3K/AKT 信號通路通過其下游的效應因子如 Rho，Racl 和 cdc42使細胞骨架重排，調節褶皺運動、細胞運動和細胞蔓延。PI3K/AKT 信號通路還可通過多種途徑上調基質金屬蛋白酶 2 ( matrix me tall oproteinase 2，MMP2) ，促進細胞侵襲。研究表明，PI3K/AKT 通路的活化使腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強，PI3K/AKT 通路抑制，可抑制細胞遷移與侵襲。Kobavashi等研究提示 pAKtser473蛋白的高表達可能參與促進胃癌細胞的侵襲轉移。王艷麗等研究提示抑制此信號通路可以抑制胃癌細胞的轉移、侵襲能力。這些研究結果均表明 PKB 與腫瘤細胞侵襲及轉移相關【2】。

PBK與胃癌

PBK與胃癌Akt及pAkt蛋白特異性過表達于胃癌組織,可能是蛋白翻譯水平和(或)代謝水平改變的結果。Akt蛋白的磷酸化可能促進胃癌細胞的惡性轉化和淋巴結轉移,VEGF-C可能在其中發揮重要的介導作用【3】。

PBK與糖尿病

葛根素可增加PKB表達并改善胰島素抵抗,該作用可能與其增強胰島素生物效應,減弱脂毒性對胰島素信號通路抑制等機制有關【5】。PKB/Akt在幾個水平上調控葡萄糖代謝。(1)通過影響葡萄糖轉運蛋白 GLUT1、GLUT3 和 GLUT4 促進葡萄糖攝取。PKB/Akt誘導GLUT1 和 GLUT3 的表達, 以及 GLUT4 向質膜的移位, 此外, PKB/Akt 也可能通過增加內吞影響葡萄糖轉運。(2)通過糖原合成酶激酶 3( GSK3)促進糖原合成。GSK- 3是第一個被發現的 PKB/Akt 的生理底物, PI3K、PDK、PKB/Akt 和 GSK3形成了胰島調節糖原合成的信號級聯系統中的一個重要支路。兩種形式的GSK3的異構體GSK3α和GSK3β的氨基端都含有PKB/Akt的磷酸化位點, 胰島素通過磷酸化和失活GSK3促進糖原合成。(3)通過磷酸果糖激酶 2(6- PF2- K)誘導糖酵解。PKB/Akt可以使心臟特異的6- PF2- KSer466發生磷酸化, 使其活化促進糖酵解【4】。

 

 

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生物學特性

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實驗儀器

測試流程

注意事項

1.具體的試驗周期以工程師告知的為準。

2.文章中的圖片或者標準以及具體的試驗方案僅供參考，因為每個樣品和項目都有所不同，所以最終以工程師告知的為準。

3.關于（樣品量）的需求，最好是先咨詢我們的工程師確定，避免不必要的樣品損失。

4.加急試驗周期一般是五個工作日左右，部分樣品有所差異

5.如果對于（B6-Akt1tm1小鼠,動物試驗）還有什么疑問，可以咨詢我們的工程師為您一一解答。