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基本信息

品系名稱：B6-Ldlr^tm1小鼠

英文名稱：B6-Ldlr^tm1 mouse

疾病名稱：動脈粥樣硬化、心血管疾病

相關基因：Ldlr

背景品系：C57BL/6J

遺傳類型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代數：NA

研究用途：用于動脈粥樣硬化、心血管疾病等及信號轉導方面的研究。

飼養環境：屏障或隔離環境

培育單位：北京華阜康生物科技股份有限公司、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

保種單位：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

資源鑒定：否

鑒定日期：暫無介紹

特征描述

 

LDLR 基因結構及其突變

LDLR 基因為一管家基因, 在基因組中的長度大于45K b.含有 18 個外顯子, 被 17 個內含子分隔開。分離并經逆轉錄得到的cDNA 為 5.3Kb。LDLR 的 3’非翻譯區為 2.5Kb, 其中含有多拷貝的 Ala 家族的重復序列。在 LDLR的任何部位出現異常都可致病, 現已發現 150 多種 LDLR 基因異常, 但大多數( 90% 以上) 的改變都不很大, 只不過是一個或幾個堿基發生異常而已。

LDLR基因家族由一類結構上與 LDL 受體相似的細胞膜表面的細胞受體組成, 其特點為所有的成員均有 4 種共同的結構: ( 1) LDL 受體配體結合重復序列; ( 2) EGF 重復序列和 EFG 前體同源域; (3) 單一的跨膜片段; (4) 至少 1 拷貝的“ NPXY” 內移信號, 迄今為止共發現 6 個LDL 受體基因家族蛋白成員。即 LDL 受體、VLDL 受體、卵黃蛋白原受體、LRP、類 LRP 分子、qp330( Heymann 腎炎抗原) 。LDL 受體基因家族的部分成員具有多功能性, 有些功能還相互重疊, 但組織分布都各有不同, 說明不同受體的具體功能與其表達場所有關。

LDLR 基因突變按LDLR 的結構標準區分至少有10種, 可分為 4 類:

第一類突變 沒有受體合成。最普通的等位基因突變,占基因突變量的一半, 此基因不產生 LDLR 或只產生微量的受體, 突變的 LDLR 基因在從外顯子 B 到內含子 Alu 重復序列元件之間缺失了一個很大的片段。

第二類突變 受體雖能合成, 但從內質網到高爾基體的運轉很慢。它僅次于第一類突變。這些突變的受體不能出現在細胞表面, 它們可能是被阻留在內質網中直至被降解。

第三類突變 受體可被加工并能達細胞表面, 但不能正常地結合 LDL, 可能是由于在富含 CYS 的 LDLR 配體結合結構域或表皮生長因子前體同源區結構域的氨基酸發生了替代、缺失或重復。

第四類突變 受體可達到細胞表面并結合 LDL, 但不能集中到被膜竇區。這些突變發生在受體的胞漿尾結構區,分三種情況。最嚴重的是距跨膜區兩個氨基酸的一個 Trp密碼子發生無義突變, 成為一個終止密碼, 使受體胞漿尾只有兩個氨基堿基。另一種突變是在緊接編碼胞漿尾的前 6個氨基酸的核苷酸序列之后的 4 個核苷酸的重復。改變了讀碼框, 導致在隨機的 8 個氨基酸序列后產生一個終止密碼。第三種突變較豐富, 為單堿基突變。在胞漿尾結構域中部, 即在受體的第 807 個氨基酸位置上一個 Cys 取代了原來的 Tyz。

LDLR 基因與高膽固醇血癥

家族性高膽固醇血癥(FH) 患者有編譯 LDLR 的基因異常。這種疾病的患者有一個正常的 LDLR 基因和一個異常的缺陷基因, 他們血漿 LDL 的水平是正常人的二倍。而且在 60 歲以前易患心臟病。較少的個體有遺傳性的 2 個LDLR 基因變異, 他們血漿中 LDL - C 水平是正常人的 6-10 倍。他們在 20 歲以前易患心臟病。盡管所有的 FH 患者都有 LDLR 基因異常, 但并不是所有的變異都是相同的。在美國, FH 家族中有 LDLR 不同部位的變異, 這些變異損傷了 LDLR 的功能。

高膽固醇血癥兔和家兔的 LDLR 基因變異已被證實。

早期一些實驗室研究表明 LDL 是以較大的脂蛋白形式- 極低密度脂蛋白 ( VLDL) 從肝細胞中分泌, 其核心富含TG 和 TC , 而大多數 TG 在毛細管中, 被脂蛋白酶分解、移走, VLDL 顆粒縮小, 重新進入血漿, 成為了中間密度脂蛋白( IDL) , IDL 富含 ApoE, 因而與 LDLR 有較強的親和力, 由于這種親和, IDL 顆粒很快進入肝臟而從血漿中清除, 因此,不難理解, 當TG 被移走、失去 AopE 時, 一些 IDL 顆粒逃脫肝臟的吸收而停留在血漿中, 成為新的物資- LDL, 由于LDL 僅含 Apo B100, 它與 LDLR 的親和力明顯低于 IDL , 所以它從血漿中被清除的較緩慢。由于這種原因, LDL 是血漿中最豐富的脂蛋白, 因為它富含TC, 攜帶了血漿中大多數的 TC。

當 LDLR 被損傷時, VLDL 仍正常分泌, 它以正常速率轉化為 IDL, 然而, IDL 不再很快地從血漿中被清除, 一些IDL 逃脫了肝臟的吸收而轉化成 LDL110、112, 因此, LDLR 缺陷導致了從血循環中清除 LDL 前體- IDL 的能力低下, 繼而 LDL 在血漿中堆積。FH 患者的 LDLR 數量平均下降50% , LDL 水平升高 2- 3 倍。

FH 雜合子可以通過刺激他們單個正常基因, 產生二倍以上的 LDLR 數量, 作為基因變異的補償治療。

最近的研究表明, 服用 HMG - Co A 還原酶抑制劑, 肝TC 合成被抑制, LD LR 數量增加。 LDL 通過增加 IDL 的清除而降低了血漿中 LDL 的形成, 也提高了 LDL 的代謝, 降低合成與增加分解導致了血漿中 LDL 水平的急劇下降。所有的這些抑制劑均有相同的作用機制, 相同的副作用。即使人體有正常的 LDLR 基因, 個體間血漿 LDL-C 水平變異亦較大, 間接證據表明, 多因素導致的高膽固醇血癥患者即使有正常的 LDLR 基因, 也產生很少的 LDLR。這種 LDLR 的缺陷有兩個因素, 一是基因; 二是環境?；蛞蛩厥侵竻⑴c LDLR 活性調節的基因, 它們可能是那些控制TC 吸收、轉化成膽汁酸、LDLR 轉錄的反饋調節基因, 或是TC 生物合成的基因, 這些基因的非常微妙的改變可能影響控制 LDLR 基因治療的調控系統, 繼而降低了 LDLR 表達。

這些導致多因素高膽固醇血癥的基因并非單獨起作用。它們與環境協同作用, 即高 TC 和飽和脂肪酸。一系列大量廣泛的動物實驗, 包括靈長目動物實驗顯示, 消化高 TC 和飽和脂肪酸飲食導致肝臟中 TC 的積聚, 這抑制了 LDLR 基因轉錄。在倉鼠和大鼠, 高 TC 飲食或飽和脂肪酸飲食抑制了 LDLR 表達。LDLR 基因的缺失、插入或堿基對變異導致基因表達異常及肝細胞表面 LDLR 表達數量的異常, 這種受體改變反映了血漿中 LDL-C 清除率的不同、不同個體血漿中 TC 含量的不同。

LDLR 基因與動脈粥樣硬化及冠心病的關系

血漿中 2/3 以上的 LDL 是通過 LDLR 途徑降解的,LDLR 基因的異常表達可影響 LDL 的清除, 使 LDL 在血漿中極度升高, 導致高膽固醇血癥。Wang AM 等人用 RT-PCR 方法, 對頸動脈及冠狀動脈組織中 LDLRm RNA 的含量進行了測定, 發現 AS 斑塊中 LDLR 轉錄水平明顯低于正常動脈組織, 提示 AS 的形成與 LDLR 的低表達有直接關系。

李錫明等人對冠心病患者血淋巴細胞 LDLRm RNA 的含量進行了測定, 發現冠心病患者血淋巴細胞 LDLRm RNA水平明顯低于正常對照組, 提示冠心病患者存在 LDLRmRNA的表達不足。秦樹存等人也發現了同樣的結果。

基因治療與高脂血癥及動脈粥樣硬化

基因治療的基本原理和作法是, 將編碼具有某種生物活性的物質(一般是蛋白質和肽) 的基因用某種載體( 消除了感染性的腺病毒或其它病毒、脂質體或人類細胞) 人為地轉移到人體或組織細胞內, 使其在局部表達該活性物質, 從而達到相應的治療或預防目的。有人以離體基因治療法治療成功一例家族性高膽固醇血癥患者, 患者的自體肝細胞經用攜帶 LDL 受體基因重組逆轉錄病毒進行了基因治療后, 再將肝細胞回輸給患者, 治療4個月后, 患者的LDL與HDL比值從治療前的 10- 13 下降到治療后的 5-8, 并對其肝組織進行原位雜交, 表明有轉基因表達細胞的植入。1152

Brousseau 等將人類卵磷脂膽固醇?；D移酶基因( lecithin cholestel acy ltransferase, LCAT ) 導入了 LDLR 缺乏的遺傳性高脂血癥家兔體內, 表明 LCAT 確實通過 LDLR途徑調節 LDL 代謝, 從而影響動脈粥樣硬化的易感性。而且, LCAT 的抗動脈粥樣硬化作用只需 1 個單一的功能性LD LR 等位基因, 從而表明 LCAT 對大多數脂質代謝紊亂的患者是一種頗具吸引力的基因治療方法?；蛑委熞言谀承┻z傳性疾病, 特別是單基因異常造成的遺傳性疾病的治療中取得了成功。但將其用于治療高脂血癥及動脈粥樣硬化尚處于研究階段。

LDLR 基因表達的調控因素

迄今為止在對不同組織和不同動物細胞的研究中, 發現LDLR 基因轉錄與反饋機制密切相關。當細胞中TC聚集時, 治療水平受到抑制。相反, 在快速生長時期, 細胞對膽固醇的需要量增加時治療過程被加速。在肝臟中, 這種反饋機制尤為重要。1172

膽固醇與 LDLRmRNA 研究表明, 飲食中的膽固醇降低了肝臟 LDLRmRNA水平, 因此降低了肝LDLR 數量, 引起血循環中 LDL 的堆積。T . D. Lecra. E 研究發現, 在基礎條件下( 10% FCS) , 肝細胞和人類成纖維細胞的 LDLRm-RNA 的表達增多, 且肝細胞比成纖維細胞增加明顯; 在含有25- 羥膽固醇和膽固醇酯的混合液中, 肝細胞和成纖維細胞的 LDLRm RNA 水平下調; 在含有 LPDS 和 2.5μm Mevinolin的細胞培養液中, 2 種細胞的 LDLRm RNA 水平上調。說明膽固醇類對LDLRmRNA有抑制作用。雌激素與 LDLRmRNA 雌激素對LDLR 活性的影響主要作用在 LDLR 的轉錄水平, 使其 mRNA 水平升高。Rai等給大鼠口服雌激素后, 大鼠肝細胞上 LDLR 轉錄水平升高2 倍?？梢? 雌激素對肝細胞膜上LDLRmRNA有強烈的誘導作用。最近研究也證明雌激素對高膽固醇血癥和冠心病患者外周血 PBMC 上 LDLRm RNA 有明顯升高作用。提示高膽固醇血癥和冠心病患者的 LDLR 損害是可逆的, 雌激素的替代治療對絕經后冠心病女性仍有積極意義。

脂蛋白與 LDLRmRNA 在肝外細胞, 不僅 LDL-C, 而且 HDL-C 也能影響 LDLR 的轉錄水平, Thomas m. Stulming 等人研究表明, 不僅血清 LDL-C , 而且HDL-C 也可下調外周血淋巴細胞 LDLRm RNA 水平, HDL-C 對之下調作用是LDL-C 的三倍, 并證實 LDL-C 與 HDL-C 是以不同的病理機制發揮各自的對 LDLRmRNA 的下調作用。

HMG- GoA 還原酶抑制劑與 LDLRmRNA LDLR 和HMG-COA 還原酶和 LDLR 是肝臟膽固醇代謝的二個關鍵物質 HMG -Go A 還原酶是肝臟膽固醇代謝的 2 個關鍵物質。HMG- CoA 還原酶的競爭抑制劑可抑制內源性 TC的合成, 誘發 LDLR 的活性, 從而降低血漿膽固醇水平。此類藥物是最有力的降低 LDL - C 的藥物, 但價格昂貴。該類藥物人體耐受性較好, 有惡心、乏力、失眠、頭痛、轉氨酶升高, 個別肌痛。在動物可引起晶狀體混濁, 其升高 LDLR 活性和 m RNA 水平的作用與其引發還原酶和 LDLR 基因表達的同時調節有直接關系, 而與載脂蛋白 B 基因無關。

生長因子與 LDLRmRNA

Youngmik Park 研究發現,肝細胞生長因子( HGF) 提高了 LDLR 基因轉錄 4- 5 倍, 用HGF 培養的肝細胞產生時間和濃度依賴型的 LDLRmRNA的增加。分裂素與 LDLRm RNA Jennifer A 等人采用人新鮮離體外周血 PBMC 進行實驗, 發現分裂素可增加 LDLR其

其他

姜傳倉等發現丹參能升高實驗性高膽固醇血癥大鼠肝及人成纖維細胞 LDLRm RNA 水平。Michihiro Fukushima 在實驗中, 亦發現蘑菇纖維素可增加高脂血癥大鼠 LDLRm RNA 水平。1242林秋實研究發現山楂及山楂酮能提高高脂血癥大鼠肝 LDLRmRNA 水平。在前期工作中,我們發現冠心康復方制劑可升高高脂血癥患者外周血淋巴細胞 LDLRm RNA 水平。進一步說明中藥可提高 LDLR基因表達, 解除 LDLR 的抑制狀態, 促進 LDLR 表達, 使血中 LDL-C 減少, 調控 了血脂水平mRNA水平【1】。

有學者報道了關于LDLR 基因多態性與心腦血管疾病的相關性研究進展

LDLR基因多態性

現已發現的LDLR基因多態性位點有22個， 其中8個限制片段長度多態性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP）較為常見，并被廣泛應用。這8個位點分別為：內含子4中的 TaqⅠ、外顯子8中的 StuⅠ、外顯子12中的 HinⅡ、外顯子13 中的 AvaⅡ、內含子 15 中的SpeⅡ、Apa LⅠ和 PvuⅡ、 外顯子 18 中的 NcoⅠ。其中 LDLR內含子15 PvuⅡ RELP 研究得最多。 在LDLR 的任何部位出現 異常都可致病 ， 現已發現150 多種 LDLR 基因異常， 但大多數（90％以上） 的改變都不很大，只不過是一個或幾個堿基發生異常而已。LDLR基因的多態性與血脂紊亂、高血壓、心腦血管疾病有關，詳細論述在文章中【3】。

還有報道對ApoE-/-和LDLR-/-小鼠模型進行比較，這兩個模型是目前使用最為廣泛的2種動脈粥樣硬化動物模型。兩者雖然均可形成動脈粥樣硬化的病灶,但在某些方面卻存在明顯的差異。該文從脂質代謝、斑塊形成及病理、淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、miRNA表達及調控等方面對這2種小鼠模型的差異性作一綜述【4】。

 

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生物學特性

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實驗儀器

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