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基本信息

品系名稱：B6-Rnf128^tm1小鼠

英文名稱：B6-Rnf128^tm1 mouse

疾病名稱：傳染性疾病、腫瘤

相關基因：Rnf128

背景品系：C57BL/6J

遺傳類型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代數：NA

研究用途：傳染性疾病、腫瘤等及信號轉導方面的研究。

飼養環境：屏障或隔離環境

培育單位：北京華阜康生物科技股份有限公司、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

保種單位：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

資源鑒定：否

鑒定日期：暫無介紹

特征描述

E3泛素連接酶RNFl28(GRAIL，gene related to anergyin lymphocytes)是一類在適應性免疫中發揮重要調節作用的蛋白。研究發現，RNFl28可以通過多種機制誘導CD4+T細胞失能。RNFl28通過泛素化作用不僅可以降解TCR-CD3(T細胞活化所需的第一信號)，還可以降解CD40L、CD83和CDl51(T細胞活化所需的第二信號及共刺激信號)，另外，RNFl28還可以可以降解T細胞與抗原提呈細胞(antigen—presenting cell，APC)接觸時免疫突觸形成的重要蛋白(Arp2／3和Coronin 1A)。大量的研究也證明，調節T細胞失能的其它幾個E3泛素連接酶Cbl．b，c—Cbl和Itch都可以參與天然抗病毒反應。但是RNFl28在固有免疫反應中是否發揮作用還未見報道。

山東大學學者通過研究報道了RNF128最新研究結論：

病毒感染后誘導Rnf128表達上調

為了研究RNFl28是否在固有免疫信號通路中發揮作用，我們首先用poly(I：C)和ISD刺激小鼠原代巨噬細胞和人單核細胞THP一1細胞，發現RNFl28的mRNA和蛋白水平在刺激后都明顯升高。類似的， RNA病毒SeV和DNA病毒HSV-1感染小鼠腹腔原代巨噬細胞和人TH-P1細胞也誘導RNFl28在mRNA和蛋白水平表達上調。

重組IFN．B刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞后，RNFl28表達水平隨著刺激時間的延長而不斷升高；封閉了IFN—B受體的實驗組在接受病毒誘導后，RNFl28的表達升高被抑制了；沉默了小鼠腹腔原代巨噬細胞中STATl和STAT2的表達，也明顯抑制了SeV-或HSV-1病毒誘導的RNFl28表達升高。

RNFl28正調IRF3活性和IFN-β信號通路

由于病毒感染引起機體的一個主要效應就是誘導產生IFN-β，我們想進一步探討RNFl28在IFN—β信號通路中的作用。在小鼠腹腔巨噬細胞和人THP-l細胞中的研究結果均顯示通過siRNA沉默RNFl28后再分別轉染Poly(I：C)、ISD或感染SeV、HSV-1，會顯著抑制Poly(I：C)、ISD、SeV和HSV-1誘導的Ifnb1及下游相關ISG基因，包括CxcllO，Mxl和Ccl5表達水平，而不影響IL-6和Tnfa的表達。轉染Poly(I：C)、ISD或感染SeV、HSV-1后，Rnf28—/一小鼠腹腔原代巨噬細胞中IFN-β的表達與分泌水平與WT組相比明顯被抑制，IFN-β下游的Cxcll0，Mxl以及Ccl5基因的mRNA水平也顯著低于WT組，而IL-6和Tnfa表達水平沒有顯著性差異。在HEK293細胞中我們發現RNFl28表達降低能夠明顯抑制TRIF信號通路以及DNA信號通路和RNA信號通路活化對IFN—β啟動子及mRNA的影響。IFN—β的啟動子區域有三個轉錄因子的結合位點，分別是IRF3， NF-KB和AP-1。分別結合到PRDII和IV區域， IRF3則結合到PRD I—III區域。RNFl28過表達能夠增強TRIF-，MAVS和cGAS+STING誘導的IFN—β活性及PRDI—III報告基因活性，而對PRDII和IV的報告基因活性沒有顯著影響。說明RNFl28通過影響IRF3進而影響IFN—β的表達。

轉錄因子IRF3的磷酸化、二聚化以及入核是IRF3活化過程的三個必要步驟，活化的IRF3才能進一步結合到IFN-β的啟動子區域，影響IFN—β的表達。我們分別向HEK293細胞中共轉染RNFl28過表達載體以及TRIF-，MAVS和cGAS+STING過表達載體，檢測IRF3的磷酸化，發現RNFl28過表達均能夠增強上述信號通路活化引起的IRF3的磷酸化水平。我們進一步以野生型和RNFl28缺陷小鼠的腹腔原代巨噬細胞為研究對象，分別用SeV病毒和HSV-1病毒感染細胞，發現RNFl28缺陷組腹腔巨噬細胞的二聚化現象較野生組明顯減弱。SeV病毒感染野生組腹腔巨噬細胞后，IRF3和P6均明顯入核，而RNFl28缺陷組IRF3的入核明顯受到了抑制，P65入核與對照組相比沒有明顯變化；同樣HSV-1病毒感染后的結果類似。

RNFl28作用靶點為TBKl

以HEK293細胞為研究對象，共轉染了RNFl28過表達質粒以及TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-，TBKl-以及IRF3 5D過表達質粒，RNFl28過表達組與對照組相比，TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-和TBKl．誘導的IFN—β表達和啟動子活性均增強，但是對IRF3 5D誘導的IFN-β表達及報告基因活性沒有影響；隨后，我們又通過RNFl28特異性小干擾RNA沉默HEK293細胞中的RNFl28表達，同樣轉入TRIF-，cGAS+STING-，RIG-1N-，MAVS-，TBKl-以及IRF3 5D過表達質粒， RNFl28沉默降低了TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-和TBKl-誘導的IFN—β表達及啟動子活性，但是對IRF35D誘導的IFN—β表達和啟動子活性沒有影響。

免疫共沉淀實驗(Co—IP)結果顯示，RNFl28只能夠與TBKl發生相互作用，而與其他接頭分子沒有相互作用。我們又通過免疫熒光實驗進行了進一步驗證。結果顯示二者間存在微弱的共定位，當激活細胞病毒感染信號通路后，共定位現象明顯增強。免疫熒光的結果與Co—IP結果一致。

RNFl28促進TBKl發生K63泛素化

向HKE293細胞中共轉染Myc-TBKl、V5-RNFl28野生型和突變載體以及泛素化(Ub)表達載體，Co-IP結果顯示RNFl28過表達確實能夠增強TBKl的泛素化。體外的泛素化系統同樣檢測到TBKl的泛素化現象。向HEK293細胞中轉入了RNFl28和TBKl的過表達質粒以及野生型(HA—Ub)和突變型的泛素化質粒，HA—ubiquitin-K48和HA—ubiquitin-K63，結果顯示RNFl28過表達誘導TBKl的泛素化主要是K63位泛素化，而對TBKl K48位泛素化沒有影響。而TBKl K30或K401位突變后，泛素化作用明顯減弱，當這兩個位點同時突變后，泛素化作用減弱更加明顯。

RNFl28促進TBKl激酶活性

為了研究RNFl28介導的TBKl泛素化是否影響TBKl的活性，我們分別檢測了WT和Rnf128-/-小鼠的腹腔巨噬細胞感染SeV病毒和HSV-1病毒后，TBKl激酶活性，發現Rnf128-/- 組的巨噬細胞感染病毒后TBKl激酶活性也明顯低于WT組。在HEK293細胞中過表達RNFl28后再感染SeV病毒與對照組相比則顯著增強TBKl激酶活性；而通過siRNA沉默RNFl28后再感染SeV病毒與對照組相比則顯著抑制TBKl激酶活性。我們又以Tbkl-/-MEFs細胞為研究對象，通過電轉分別轉入Myc-TBKl-WT、 Myc-TBKl-K30R、Myc—TBKl一K401R和Myc．TBKl．K30R—K401R表達質粒。Myc—TBKl一WT轉入組檢測到顯著的TBKl激酶活性以及TBKl磷酸化和勵6J表達，而轉入RNFl28過表達載體能夠進一步增強TBKl磷酸化和Ifnb1表達，而TBKl-K30R、TBKl-K401R和TBKl-K30R-K401R轉入組過表達RNFl28并不能增強TBKl磷酸化和 Ifnb1表達。

RNFl28調節TBKl活性具有普遍性

已有文獻報道MIBl、MIB2和Nrdpl能夠促進TBKl發生K63泛素化。為了研究MIBl、MIB2和Nrdpl的泛素化功能與RNFl28對TBKl活性調控的關系，我們分別設計了MIBl、MIB2和Nrdpl的siRNA，并轉入Rnf128-/-的小鼠腹腔巨噬細胞中。LPS誘導后，siRNA沉默MIBl／MIB2組與對照組相比能夠顯著抑制SeV-誘導的砌6J表達以及IRF3和TBKl磷酸化，而LPS-或HSV-l-感染后則沒有這種差異；siRNA沉默Nrdpl組與對照組相比能夠顯著抑制Ifnbl表達以及IRF3和TBKl磷酸化，而SeV-或HSV-1-感染后則沒有這種差異。

RNFl28能夠增強機體抗病毒能力

IFN—β的主要功能就是抗病毒感染，下面我們想繼續探討RNFl28對抗病毒功能的影響。我們以野生型和RNFl28缺陷小鼠的腹腔原代巨噬細胞為研究對象，分別感染了VSV和HSV-1病毒，通過空斑實驗檢測病毒滴度，結果顯示RNFl28缺陷組不論被RNA病毒還是DNA病毒感染后，病毒滴度都比野生組顯著升高。體外試驗證明，RNFl28可以增強細胞的抗病毒能力，我們取野生型和RNFl28缺陷小鼠各3只，尾靜脈注射VSV或HSV-1后檢測血清中IFN—β的水平，發現不論是RNF病毒還是DNA病毒感染后，缺陷組血清中IFN—β水平都顯著低于野生組；3天后，將小鼠處死，對VSV感染組，分別檢測小鼠肝和肺中VSV病毒的滴度和復制，發現Rnf128-/-組顯著高于wT組；對于HSV-1感染組，檢測腦組織中HSV-1病毒的滴度和復制，同VSV組一樣，缺陷組病毒滴度和復制水平較野生組組顯著升高。致死實驗發現RNFl28缺陷組小鼠，不管對VSV還是HSV-1，都更易被感染，生存率降低【1】。

RNF128與非小細胞肺癌 RNF128高表達促進NSCLC侵襲轉移,其表達可能是NSCLC的一個新的預后預測指標及潛在的治療靶點。

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